رنگ آمیزی گرم باکتری چیست و چگونه انجام می شود؟

باکتری ها از موجودات زنده ای هستند که مطالعه بر روی آن‌ها اهمیت ویژه ای دارد. باکتری ها انواع مختلف داشته و برخی از آن‌ها برای سلامت مفید و برخی دیگر مضر هستند. برای اینکه بتوان نمونه های بالینی را در زیر میکروسکوپ بررسی نمود، اغلب از رنگ هایی مخصوص استفاده می‌شود. درواقع در بررسی میکروارگانیسم های همچون باکتری ها، رنگ به‌عنوان یک ابزار شناسایی و معیاری برای تشخیص است. رنگ آمیزی گرم باکتری یکی از انواع رایج رنگ آمیزی محسوب شده و کارایی بالایی در تشخیص دارد. روش رنگ آمیزی گرم چندین مرحله دارد که در پایان اطلاعات مهمی را حاصل می‌آورد. آزمایش رنگ آمیزی گرم را می توان با رنگ کریستال ویوله انجام داد.

نتیجه‌گیری رنگ آمیزی گرم باکتری این است که باکتری های گرم منفی به رنگ صورتی و باکتری های گرم مثبت به رنگ آبی بنفش در زیر میکروسکوپ نوری دیده می شوند. بنابراین استفاده از روش رنگ آمیزی گرم باکتری می‌توان به وجود یا عدم وجود باکتری و همین‌ طور نوع آن‌ها پی برد.

در ادامه این مطلب از جهان شیمی فیزیک به بررسی رنگ آمیزی ساده باکتری و بررسی روش رنگ آمیزی گرم باکتری می‌پردازیم. در این مقاله رنگ آمیزی گرم همراه با باشید.

باکتری چیست

اولین جانداران پدید آمده در زمین باکتری ها هستند. این موجودات در دسته پروکاریوت ها قرار داشته و از بزرگ‌ترین های آن محسوب می‌شوند. برای بار اول آنتونی فیلیپس فان لیوونهوک در قرن ۱۷ میلادی توانست با نمونه گیری از دهانش باکتری ها را شناسایی کند. به همین دلیل به نام پدر علم میکروب شناسی شهرت یافته است. باکتری ها در همه جای کره زمین وجود دارند. بدون وجود باکتری‌ها امکان زندگی برای انسان‌ها نیز امکان پذیر نخواهد بود. باکتری ها در انواع میله ای، مارپیچی و یا کروی یافته می‌شوند. این موجودات تک‌ سلولی و ذره‌بینی بوده و با پوشش بیرونی نسبتا ضخیمی احاطه شده اند. این موجودات ساختاری ساده‌ای دارند و از متنوع ترین و مهم ترین میکروارگانیسم ها محسوب می‌شوند. تعداد کمی از باکتری ها هستند که برای انسان و حیوانات و گیاهان ایجاد بیماری می‌کنند. باکتری ها حیات را بر روی زمین امکان پذیر نموده‌اند.

ساختار باکتری

باکتری‌ها از هسته سازمان یافته ای برخوردار نبوده و DNA و پروتئین های همراه آن در درون ناحیه نوکلئوتیدی جای گرفته و اجزای سلولی شان در سیتوپلاسم پراکنده گشته‌اند. این موجودات فاقد کروموزم های غیر مشابه و جداگانه اند. بیشتر باکتری ها بدون کلروفیل بوده و از طریق شیمیوسنتز متابولیسم می کنند. باکتری‌ها هسته سازمان یافته و مشخصی ندارند، بنابراین میوز و میتوز و تولید مثل جنسی ندارند. تقسیم سلولی در آن‌ها تقسیم دوتایی بوده که پس از همانندسازی و مضاعف شدن کروموزوم ها صورت می‌پذیرد.

انواع باکتری

باکتری‌ها بر اساس تفاوت در ساختار دیواره به دو دسته گرم مثبت و گرم منفی تقسیم می‌شوند. باکتری های گرم منفی با رنگ آمیزی گرم، به رنگ صورتی در خواهند آمد. این باکتری ها دارای غشای لیپوپلی ساکاریدی و لایه ای نازک از پپتیدوگلیکان هستند. این باکتری ها نسبت به آنتی بیوتیک ها حساس هستند. باکتری های گرم مثبت انواع دیگری هستند که در رنگ آمیزی گرم به رنگ بنفش در می‌آیند. این باکتری ها پوشش باکتری های گرم منفی را ندارند. اما در دیواره سلولی از اسیدهای تیکوئیک و یک پپتیدوگلیکان ضخیم تشکیل شده‌اند. این باکتری‌ها در مقابل آنتی بیوتیک ها مقاومند.

انواع رنگ آمیزی باکتری

تکنیک‌های متعددی برای رنگ آمیزی باکتری ها وجود دارد. رنگ آمیزی به‌عنوان یکی از عمده ترین روش ها جهت مشاهده، تمایز و جداسازی باکتری ها از یکدیگر محسوب می‌گردد. در رنگ آمیزی ساده مانند رنگ آمیزی با متیلن بلو، تمام بخش های نمونه به صورت یکسان رنگ می شود. از این نوع رنگ آمیزی برای مشاهده شکل، اندازه و شمارش میکروب ها استفاده می شود.

در رنگ آمیزی افتراقی همچون رنگ آمیزی گرم نیز با توجه به اختلاف های ساختمان میکروارگانیسم ها می توان آن‌ها را از یکدیگر تشخیص داد.

رنگ آمیزی اختصاصی مثل رنگ آمیزی دانه های متاکروماتیک، تنها گروهی از میکروارگانیسم ها رنگ شده و از این رو یک روش شناسایی محسوب می‌گردد.

برای طبقه بندی آن‌ها از یک ویژگی مهم استفاده می‌شود و آن ویژگی پاسخ باکتری ها نسبت به رنگ آمیزی گرم است. البته واکنش نسبت به رنگ آمیزی گرم به تعداد زیادی از ویژگی های مورفولوژیک باکتری هایی وابسته است که از لحاظ تکاملی با هم ارتباط دارند. روش رنگ آمیزی گرم توسط یک رنگ قلیایی (اغلب کریستال ویوله) صورت می‌پذیرد.

روش رنگ آمیزی گرم چیست

از معروف‌ترین نوع رنگ آمیزی های مرکب، نوع گرم است. این روش از مفیدترین روش تشخیص باکتری ها محسوب می‌گردد. در سال  میکروب شناسی ۱۸۸۴ به نام کریتستیان گرم به‌طور تصادفی موفق به کشف واکنشی شد که بعدها به نام واکنش رنگ‌آمیزی گرم شناخته شد.

باکتری‌ ها با توجه به ساختمان دیواره سلولی به دو بخش بزرگ و کلی تقسیم می‌شوند. باکتری های گرم مثبت و باکتری های گرم منفی. این دو گروه دارای تفاوت های عمده ساختاری هستند. در دیواره سلولی گونه های گرم مثبت نوعی پلی ساکارید به کار رفته و از دیواره سلولی کمی ضخیم تر برخوردار است. در دیواره سلولی انواع گرم منفی مقدار چربی بیشتر است و دیواره سلولی آن‌ها کمی نازک تر از نوع گرم منفی است. این تفاوت در دیواره سلولی موجب تفاوت رنگ در هنگام رنگ آمیزی آن‌ها شده است. درواقع روش رنگ آمیزی گرم بر همین مبناست.

خواص باکتری های گرم مثبت و گرم منفی

باکتری های گرم مثبت نسبت به پنی سیلین و مواد ضد باکتریایی حساس تر از باکتری های گرم منفی هستند. گرم مثبت بودن خاصیتی متغیر است، اما خواص گرم منفی تحت هیچ  شرایطی از بین نمی‌روند. بنابراین در لام های گرم مثبت ممکن است اجرام گرم منفی نیز مشاهده گردند. اما هیچ‌گاه در لام های گرم منفی، باکتری گرم مثبت دیده نخواهد شد.

رشد باکتری های گرم منفی نسبت به باکتری های گرم مثبت سخت تر است و این موجودات نیازهای غذایی پیچیده تری دارند.

از طرفی باکتری های گرم منفی نسبت به اسید و قلیا حساسیت بیشتری دارند.

باکتری های گرم مثبت تحت تاثیر آنتی بیوتیک ها دیواره سلولی خود را از دست داده و به پروتوپلاست تبدیل می گردند. پروتوپلاست ها نیز بسیار شکننده بوده و تنها در محیط های هم فشار قادر به ادامه زندگی هستند. پروتوپلاست ها (غشا + سیتوپلاست) کاملا قابلیت سنتز دیواره سلولی از دست خواهند داد.

با از دست رفتن دیواره سلولی در باکتری های گرم منفی آن‌ها به اسفروپلاست تبدیل خواهند شد. اسفروپلاست قطعاتی از دیواره سلولی را در خود حفظ کرده و بنابراین قادر به سنتز مجدد دیواره سلولی خواهد بود.

در صورتی که قابلیت رشد و تکثیر در سلول های فاقد دیواره حفظ شود، این باکتری ها تحت عنوان اشکال L- باکتری نامیده می‌شوند. این فرم از باکتری ها در عود مجدد بیماری های عفونی نقش بسزایی ایفا می کنند.

نحوه رنگ آمیزی گرم در باکتری ها

رنگ آمیزی گرم با توجه به تفاوت مهم در دیواره سلولی باکتری ها صورت گرفته و در آن از دو نوع رنگ استفاده می‌شود. رنگ اولیه مورد استفاده رنگ کریستال ویوله است. محلول کریستال ویوله به گسترش باکتریایی اضافه شده و با ریبونوکلئات موجود در دیواره سلولی ترکیب می گردد. کمپلکس کریستال ویوله- ریبونوکلئات حاصل این ترکیب است. پس از شستشوی رنگ اضافی از محلول ید استفاده می شود. محلول ید ترکیبی است که به رنگ متصل شده و یک ترکیب رنگی غیر محلول ایجاد خواهد نمود.

کمپلکس تشکیل شده جدید کریستال ویوله- ید نام دارد. سر دیگر این کمپلکس به ریبونوکلئات در دیواره سلولی متصل شده است. بنابراین کریستال ویوله- ید- ریبونوکلئات تشکیل می شود. این در حالیست که در باکتری های گرم منفی چنین کمپلکسی را ایجاد نخواهند نمود. پیوند بالا در باکتری های گرم مثبت بسیار پایدار بوده و پس از افزودن ماده رنگ بر شکسته نمی شود. درواقع انواع گرم مثبت رنگ بنفش کریستال ویوله را در خود حفظ کرده و زیر میکروسکوپ به رنگ بنفش دیده می‌شوند.

نحوه رنگ آمیزی گرم در باکتری های گرم منفی

در دیواره سلولی باکتری های گرم منفی مقدار چربی بیشتری بکار رفته است. چربی ها در الکل و استن که به‌عنوان رنگ بر استفاده می شوند، قابل حل هستند. چربی ها در اثر این واکنش از دیواره سلولی خارج شده و رنگ کریستال ویوله در اثر شستشو با حلال رنگ بر از سطح باکتری خارج می شود.

درواقع با خروج چربی توسط ماده رنگ بر، اندازه منافذ دیواره سلولی افزایش یافته و این امر باعث بی رنگ شدن سریع باکتری های گرم منفی می گردد. بنابراین در این مرحله کریستال ویوله پاک از باکتری های گرم منفی پاک می شود. در ادامه پس از شستشو توسط آب و افزودن رنگ دوم یعنی سافرانین (فوشین) به دیواره سلولی باکتری های گرم منفی جذب شده و باکتری ها به رنگ قرمز در خواهند آمد. در نهایت در بررسی های میکروسکوپی، باکتری های گرم منفی به رنگ قرمز دیده خواهند شد.

لازم به ذکر است که اغلب باکتری های موجود، گرم منفی هستند. تنها برخی از باکتری ها، مخمرها و کپک ها به صورت گرم مثبت هستند.

مراحل رنگ ‌آمیزی گرم

رنگ ‌آمیزی گرم (Gram’s stain) از رایج‌ترین روش های رنگ ‌آمیزی‌ها محسوب می شود. رنگ آمیزی گرم برای اولین بار توسط کریستین گرم ابداع شد و طی مراحل زیر صورت می پذیرد.

تهیه گسترش

در این مرحله روی یک صفحه لام، لایه نازکی از نمونه باکتری رشد کرده را گسترش می‌ دهند. نمونه باید از کناره‌های لام فاصله داشته باشد. برای نمونه‌های رقیق، پس از سانتریفیوژ، گسترش تهیه می گردد.

خشک کردن

آنچه بر روی لام قرار می‌گیرد، نیاز به خشک شدن دارد. بنابراین باید در مجاورت هوا خشک گردد. برای نمونه‌های خطرناک باکتری، فرآیند خشک کردن باید در اتاق ایمن صورت پذیرد.

تثبیت کردن

نمونه با عبور لام از روی شعله (۳ تا ۴ بار) و یا با استفاده از صفحه گرم کننده بر روی لام تثبیت می گردد. البته برای تثبیت نمونه گاهی از الکل استفاده می‌ شود.

رنگ آمیزی گرم

در این مرحله، ابتدا باید سطح گسترش به مدت ۱ دقیقه با رنگ کریستال ویوله پوشش ‌و سپس با آب شستشو داده شود. در ادامه سطح به مدت ۱ دقیقه با محلول لوگل (Lugol’s iodine) یا محلول ید پوشش داده شود. سپس سطح گسترش با آب شسته و با رنگ بر شستشو داده می شود. در ادامه لام با آب شستشو داده شده و سطح گسترش با سافرانین به مدت ۱ دقیقه پوشانده می شود. سپس دوباره شستشو با آب صورت گرفته و در نهایت لام خشک می گردد. پس از انجام این فرآیند، رنگ آمیزی صورت گرفته و می ‌توان نمونه‌ها را در زیر میکروسکوپ مشاهده نمود.

مشاهده و تشخیص گرم باکتری‌ها با میکروسکوپ نوری

باکتری‌های گرم منفی در زیر میکروسکوپ‌ نوری به رنگ صورتی قرمز دیده می‌شوند. باکتری‌های گرم مثبت نیز به رنگ آبی تیره تا بنفش قابل رویت هستند.

مزایا رنگ آمیزی گرم

رنگ آمیزی گرم روشی آزمایشگاهی و باکتریولوژیکی است که جهت تمایز گونه های باکتریایی براساس خصوصیات بدنی دیواره های سلولی گروه های گرم مثبت و گرم منفی استفاده می‌شود. از رنگ آميزی گرم برای طبقه بندی آرکی ها (Archaeans) استفاده نمی شود. زيرا اين ميكروارگانيسم ها پاسخ های متفاوتی ارائه داده و از گروه های فيلوژنتيكی تبعيت نمی‌کنند. رنگ آمیزی Gram یک ابزار دقیق برای تشخیص، شناسایی و یا فیلوژنی نیست. این روش در میکروبیولوژی محیطی کاربردی بسیار محدود دارد.

موارد استفاده رنگ آمیزی گرم

این ماده به‌طور عمده در شناسایی اولیه مورفولوژیک یا تعیین وجود تعداد قابل توجهی از باکتری ها در یک نمونه بالینی به کار گرفته می شود. توجه شود که این روش قادر به تشخیص باکتری ها در سطح گونه نیست. و در پزشکی نباید از آن به‌عنوان تنها روش شناسایی باکتری ها استفاده نمود. برای شناسایی باکتری ها در آزمایشگاه های میکروبیولوژی بالینی، امروزه از رنگ آمیزی گرم در ترکیب با سایر تکنیک ها استفاده می‌کنند. بعضی از میکروارگانیسم ها متغیرهای گرم هستند. یعنی ممکن است رنگ منفی یا مثبتی داشته باشند. برخی دیگر نیز به هیچ کدام از دو رنگ استفاده شده در روش رنگ آمیزی گرم جواب نداده و دیده نمی شوند.

بیشترین شناسایی در یک آزمایشگاه میکروبیولوژی مدرن محیطی یا مولکولی توسط توالی ژنتیکی و تکنیک های مولکولی دیگر صورت می‌پذیرد. این روش ها نسبت به رنگ آمیزی های تمایزی به مراتب خاص تر هستند.

نتیجه آزمایش رنگ آمیزی گرم باکتری

• باکتری های گرم منفی در رنگ آمیزی صورتی قرمز می‌شوند.
• باکتری های گرم مثبت به رنگ آبی و بنفش درخواهند آمد.

سخن آخر

در این مطلب از جهان شیمی فیزیک به بررسی رنگ آمیزی گرم باکتری ها پرداختیم. این بررسی نشان داد که روش رنگ آمیزی روشی مناسب برای تشخیص باکتری های گرم مثبت از گرم منفی است. اما باید توجه شود که این روش برای شناسایی باکتری ها کافی نیست و به روش های شناسایی دیگری نیز احتیاج است.